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海报展示:

用于毒理学研究的人细胞为基础的三维结肠组织模型

Jon Oldach, Camden Holm,尤利娅•Kaluzhny, 亚历克斯Armento, Seyoum Ayehunie.

马泰克公司，阿什兰荷马大道200号，马萨诸塞州01721.

会话:
星期三，三月三十日| 10:45AM - 12:30PM

摘要
本研究的目的是重建和表征一个基于原代细胞的人三维结肠组织模型，用于研究1)微生物组, 2)结直肠护理产品的刺激性筛选, 3)抗微生物产品和结肠靶向候选药物的安全性和有效性, 和4)炎症. 本研究描述了一种由正常人类原代结肠上皮细胞(CEC)重建的新型体外组织模型的结构特征，该模型有或没有成纤维细胞. 将原代细胞在单层培养中扩张，并将其接种到微孔膜衬垫上，重建三维器官型CEC组织. 然后，对组织的上皮细胞极性进行表征(H&E染色), 成纤维细胞标记物(共聚焦显微镜), 屏障完整性(上皮间质电阻, te)测量, 用吲哚美辛(0.01-0.5mg/mL)和SN38 (20 uM)急性根尖暴露24小时.  3D结肠组织模型分析显示:1)壁到壁组织生长, 2)上皮细胞形态与人结肠相似, 3) a physiological TEER value of >300 Ώ*cm2 mimicking the colon microenvironment, 4)上皮细胞标志物CK19的表达, 波形蛋白(成纤维细胞标志物), 和Alcian blue PAS染色(产生粘液杯状细胞标记物). 吲哚美辛急性暴露(0.5%)， SN38 (20uM)为21.2%和22%.TEER值下降3%, 分别, 与未经处理的对照组相比，这表明试验物品的毒性.  这一新的人类细胞为基础的CEC组织模型将是一个有用的工具，为临床前评估微生物群落, 粘膜炎症, 并筛选结直肠护理产品的刺激潜力.  这样的模型也可以减少动物实验的使用.

用于毒理学研究的器官型3D人鼻部组织初级模型.

Seyoum ayeunie¹，扎卡里·史蒂文斯¹，Julia Oh²，尤利娅•Kaluzhny¹，亚历克斯Armento¹.

马萨诸塞州阿什兰荷马大道200号，凯发体育最新版 Corporation¹.

²杰克逊实验室，法明顿探索大道10号，邮编860-837-2014

会话:
星期一，3月28日| 9:00AM - 10:45AM

摘要

鼻粘膜是人体吸入化学物质的第一道防线, 药物, 和呼吸道感染. 在此，我们开发了一种基于体外原代人细胞的3D人鼻上皮组织(NET)，该组织位于气液界面的跨孔膜(ALI)上。.  NET组织具有组织学特征, 屏障功能(te), 可行性(MTT), 毒性, 以及病毒感染.  组织学和免疫组织化学评估 在体外 鼻模型呈现极化和多层组织，表达上皮细胞标志物(CK19), 紧密连接(ZO-1和Claudin-1), MUC5B和MUC5AC, SARS-CoV-2入口相关/蛋白/基因(ACE-2和TMPRSS2), 和纤毛(alpha-tubulin). 对分化的NET培养物的单细胞测序也证实了分化细胞类型的存在(杯形, 俱乐部的细胞, 基底, multiciliated细胞, 和之前未识别的单元格(NPIC)). NPIC在过敏性鼻炎/呼吸道合胞病毒感染时富集(增加 IL1RL1, MMP9, MMP10)和一些层蛋白和整合素. NET病毒感染也表现出高表达 IDO1, 哪些与先天抗病毒免疫功能有关. 为了监测重现性，对N=9个批次的MTT和TEER结果进行分析. MTT showed OD value of  >1.0(平均OD =1.52±0.23). N=9个批次的TEER平均值为303±98 Ω*cm². 评价鼻组织模型在毒理学研究中的应用, 我们测试了一种已知的粘膜刺激物丁胺在暴露于0.5 mg/ml和2 mg/ml的试验品. 数据显示屏障完整性下降了33.2% ± 0.0到12.3 ± 5.8日分别. 相比于车辆控制(玉米油)，这表明试验品的毒性.  简而言之, 这个新的NET模型可以添加到三维呼吸组织模型工具箱中，以预测化学吸入剂的安全性, 治疗候选人, 入境部位的病毒和细菌感染.

生理相关的应用 体外吸入 模型预测雾和挥发性液体的急性呼吸毒性

尤利娅·卡鲁兹尼¹. 杰克逊¹J. Marcus²，Olivia Gabriel¹，Paul Kearney¹，S. Letasiova²，Mitchell Klausner¹，亚历克斯Armento¹

¹凯发体育最新版公司，阿什兰，马萨诸塞州，美国

²凯发体育最新版体外生命科学实验室，布拉迪斯拉发，斯洛伐克

会话:
3月29日星期二| 2:30PM - 4:15PM

摘要

为了评估吸入物质的健康影响，需要进行急性呼吸毒性(ART)检测. 经合组织接受的方法采用基于动物死亡的GHS分类. 目前还没有经过验证的体外ART检测方法, 尽管动物试验被认为是人类反应的预测者，而且在伦理上是不可信的. 这项工作的目标是利用epi气道™组织模型开发与生理相关的ART测试, 展示多个实验室的可转移性, 并将结果与建立的与人类呼吸刺激有关的分类系统相关联.

试验品(TA)应用于气道组织(0.6 cm²), n=53)和IVLSL(斯洛伐克, n=43)，为喷雾/喷雾暴露制定了ART协议(直接应用协议), DAP)和蒸气/挥发性液体(蒸汽帽协议, VCP). 在两种方案中，组织暴露4小时至4个固定剂量的TA (0.5、2、10、20毫克/张，用玉米油或水稀释). 衣冠楚楚的, TAs被应用于根尖组织表面和VCP中-在一个特殊设计的盖子中的吸收材料，在组织上方形成一个紧密的密封，允许暴露于TA蒸气. 对组织活力(MTT试验)和屏障特性(上皮间质电阻)的影响, te)测定. 将有效剂量使组织活力降低25% (ED-25)或75% (ED-75)的方法用于DAP和VCP方法进行数学插值, 分别. ED-25和ED-75与OSHA列出的急性刺激健康影响(HE)规范(HE14/15/16)相关, 哪些与人类接触有关. MTT法测定DAP与HE14/15/16之间的差异&NH的敏感性/特异性/准确性(S/S/ a)为72.2/85.5/78.8%; correlation to GHS Cat.1&2/3&4/5&NC的结果为55.9/74.0/64.9%的S / S / A. VCP区分S/S/A值为80的HE编码.9/90.5/85.7% (凯发体育最新版)和77.0/88.7/82.8% (IVLSL); correlation to GHS was 68.0/81.2/74.6% S/S/A (凯发体育最新版)和62.2/76.1/69.1% (IVLSL).

两种方案都证明了人类HE代码的高预测性, 哪些类别比GHS类别更与人类呼吸毒性有关. 观察到VCP有良好的实验室重现性. VCP和DAP具有生理上的相关性, 器官特异性体外试验，可以提高人类反应的预测性，并显著减少使用的动物数量.

3D大鼠气道组织模型用于转译毒理学研究

马特奥Frare, 罗伯特·杰克逊, 萨曼莎杜兰,尤利娅•Kaluzhny, 蒂姆·兰德里, 亚历克斯Armento, 和塞尤姆Ayehunie.

马泰克公司，阿什兰荷马大道200号，马萨诸塞州01721.

会话:
星期一，3月28日| 9:00AM - 10:45AM

摘要

需要一种可伸缩和可复制的体外大鼠气道组织三维器官型模型来复制生物反应，以提供传统的替代方法 在活的有机体内 大鼠毒性试验. 本研究的目的是测试一种以原代细胞为基础的3D大鼠上皮气道组织(REAT)模型的实用性:1)毒性物质, 2)吸入药物, 3)针对其刺激性的配方. 为了实现这个目标, 单层培养扩增原代细胞，将原代细胞接种到微孔膜支架上，重建三维器官型REAT组织. 然后, 组织的特征是上皮细胞的极性(组织学), 上皮细胞标志物(共聚焦显微镜), 屏障完整性(上皮间质电阻, 三通), 药物转运体和药物代谢酶的表达(RT-PCR). 使用4种不同危害等级的化学品在4种浓度下测试了毒理学研究的功能(5, 25, 125, 和250毫克/毫升). Analysis of the 3D REAT revealed a well polarized epithelium and a physiological TEER value of >300 Ώ*cm2 mimicking the airway microenvironment.  RT-PCR结果显示药物转运蛋白(内流和外排)的表达, 药物代谢酶(醛脱氢酶2, 3a1, 3b1, 5a1, 6a1, 7a1, 和9 a1), CYP450酶(1 b1, 26b1, 2c80, 2f4, 2s1, 2t1, 3a9, 和4 f6), 和酯酶D.   MTT分析显示，急性暴露于化学物质后，组织活力(毒性)水平不同. 根据将组织活力降低25%所需的最低浓度, the test chemicals were rank ordered from high to minimal 毒性: Propamocarb (25 mg/mL) > Diazinon (125 mg/mL)> Malathion (250 mg/mL)> Permethrin (>250 mg/mL), 车辆控制.  因此, REAT组织模型将是预测大鼠气道毒性和连接啮齿类动物向人类转化的有效工具 在体外 吸入毒理学数据. 这样的模型也可以减少动物实验的使用.

新型高通量细胞培养板，用于三维组织培养和毒理检测

米切尔·克劳斯纳，尤利娅·卡鲁兹尼，乔治·R. 杰克逊，保罗·卡尼，亚历克斯·阿门托

凯发体育最新版公司，阿什兰，马萨诸塞州，美国

会话:
星期一，3月28日| 9:00AM - 10:45AM

摘要

一个新的, 研制了带微孔过滤底的96孔高通量(HTP)细胞培养插入板，用于毒理检测.  微孔聚碳酸酯膜底孔密度高(1 × 10)⁸ 毛孔/厘米²)，平均孔径为0.4µm培养高分化的三维组织模型.  通过培养气管-支气管上皮细胞2周，形成上呼吸道组织的器官型模型，验证了新型HTP平板的实用性.   H&E染色组织横切面显示假层状形态，同时有纤毛和粘液产生细胞, 与单孔细胞培养插入(SW-CCI)版本的组织形态相似.   HTP组织的屏障特性, 经上皮间电阻(三通)测定, 与SW-CCI组织无明显差异.   TEER测量值分别为654±204 (n=96)和809±147 (n=4) Ω*cm²，分别为SW-CCI和HTP组织(p=0.12).  利用3种呼吸道刺激物(RI)对组织进行毒理学检测的效用进行了研究。, 丙酮(AC), 甲基丙基酮(MPK), 和甲醛(对), 和HTP组织的结果与SW-CCIs培养的组织的结果进行了比较.  每个RI的4个剂量应用于组织的根尖侧4小时, 恢复20小时后用MTT法测定组织活力.  有效剂量降低组织活力25% (ED-25)是数学插值的.   HTP和SW-CCI组织的ED-25值具有可比性. HTP组织的ED-25值为38.6, 22.0, and <0.8毫克/厘米² AC的组织表面, MPK, 和, 分别, 以及SW-CCI组织, ED-25值为45.1, 20.9, and <0.8毫克/厘米².  我们预计，这种新的HTP板将有助于药物开发/配方过程中大量制剂的毒理学筛选.

眼刺激物的识别与分类 Epi眼 组织模型。液体和固体的预测模型

西尔维亚Letasiova¹, Lenka Hudecova¹Jan马库斯¹,尤利娅•Kaluzhny²,米奇Klausner²

11 凯发体育最新版体外生命科学实验室，Mlynske Nivy 73,82105，斯洛伐克，布拉迪斯拉发

²凯发体育最新版公司，美国马萨诸塞州阿什兰荷马大道200号

会话:
星期一，3月28日| 9:00AM - 10:45AM

摘要

严重眼睛损伤/眼睛刺激的测定最初涉及使用实验动物(OECD TG 405).  In 2015, 一项新的测试指南(OECD TG 492)被接受，该指南允许使用基于重建的人类角膜样上皮(RhCE)的体外程序来区分不需要分类的化学物质(物质和混合物)和那些必须标记眼睛刺激或严重眼睛损害的化学物质. 被确定为需要对眼睛刺激/严重眼睛损害进行分类的化学品，必须进一步进行测试，以区分眼睛刺激物和造成严重眼睛损害的化学品.  已经有几个项目侧重于开发眼刺激评估的分层测试策略，其中考虑了分类的所有驱动因素.  这些项目的目标是制定一项测试策略，将以下化学品分类:a)不需要对严重眼睛损伤或眼睛刺激进行标识(无类别), b)可造成严重眼睛损伤(第一类或第一类), 及c)是眼睛刺激物(第2类或第2类).

在当前项目中, 使用RhCE模型测试了一组13种化学品(7种液体和6种固体)，这些化学品在OECD TG 492B草案中被列为熟练化学品, Epi眼. 我们采用了CON4EI项目中开发并在ALT4EI项目中确认的测试策略, 哪一个结合了最具预测时间点的表眼毒性时间纯和稀释方案.  液体和固体分别用不同的方法和预测模型进行测试. 化学品组由4种Cat 1化学品、5种Cat 2化学品和4种No Cat化学品组成. 使用建议的测试策略, 我们能够正确识别100%的Cat 1化学物质(4/4), 100%含Cat 2类化学品(5/5)及100%不含Cat类化学品(4/4).

CON4EI提出并在al4ei项目中得到验证的测试策略，实现了对所有三类物质的最佳预测——液体和固体的预测模型似乎是综合测试策略(ITS)中一个非常有前途的工具，它可以区分化学品和No Cat, 猫2和猫1.

Organotypic 小肠模型 用于长期高通量毒性筛选研究

Zachary Stevens, Paul Kearny,米奇Klausner,尤利娅•Kaluzhny, 亚历克斯Armento和Seyoum ayeunie.

马泰克公司，阿什兰荷马大道200号，马萨诸塞州01721.

会话:
星期三，三月三十日| 10:45AM - 12:30PM

摘要

外肠组织模型已被用于研究多种影响胃肠道(GI)的现象，包括药物的渗透和代谢, 药物毒性, 胃肠道炎症, 和微生物感染.   最近, 该模型已被用于研究SARS-CoV-2的感染, 导致COVID-19大流行的冠状病毒. 目前的工作重点是将该模型应用于新制造的96口井, 高通量格式为长期研究延长培养期. 将正常人小肠细胞植入96孔, 微孔膜底板，培养2周，重建肠道组织.  由此产生的组织具有绒毛结构和屏障特性类似于原生肠道组织, 上皮间电阻(三通)值为160-300欧姆* cm².  这些培养物保存3个月以上，每周监测组织组织学和屏障完整性. 监测井间组织的重现性, 每周对96孔组织进行TEER测量. 组织学横切面显示，在3个月及以上的所有时间点固定的组织结构和形态与标准的肠外组织模型和原生肠组织相似.  免疫组化染色显示上皮标记物(CK19), 紧密结形成(ZO-1), 而刷边标记绒毛与标准组织模型相似.  可长期培养(3个月)的肠道器官型组织可用于慢性暴露毒性研究. 总之, 新制备的平板支持长时间重建肠外组织，可用于高通量识别影响胃肠道的化学物质和纳米颗粒的危害，并研究慢性暴露后的药物安全性和有效性.

利用体外再造的人体 角膜组织 评估全身药物眼部副作用的模型

米里亚姆·金努西亚，尤利娅·卡鲁兹尼，米奇·克劳斯纳，亚历克斯·阿门托

凯发体育最新版公司，阿什兰，马萨诸塞州，美国

会话:
星期一，3月28日| 9:00AM - 10:45AM

摘要

长期使用全身药物会引起光敏感, 疼痛, 角膜水肿和炎症, 和/或细胞毒性. 动物试验往往无法预测人类的反应. 全世界都需要与生理相关的东西, 以人体原代细胞为基础的组织模型，用于评估新药配方的眼部安全性.

我们利用体外重建的EpiCorneal™组织模型来分析已知的眼部不良反应的常用药物的影响. 用正常人角膜上皮细胞培养角膜上皮层组织, 表达位点特异性粘蛋白和紧密连接, 和获得的形态, barrier properties (Transepithelial electrical resistance or TEER > 1000±200 Ω*cm²)和基因表达可与在体人类角膜相媲美. 组织性能, TEER和组织活力测定(MTT法), 在模拟的航运条件下，24小时和96小时后是否具有可比性.

盐酸氯丙嗪的作用, a common psychotropic agent; Hydroxychloroquine sulfate (HCQ), an anti-inflammatory / anti-malaria drug; Alfuzosin hydrochloride (ALF), antihypertensive drug; and Fosamax (Alendronate Sodium, ”丛书), 一种常见的抗骨质疏松剂, 研究了. 终点包括MTT、TEER、组织学、LDH和细胞因子释放. 组织在含有生理相关浓度药物的培养基中孵育24h和48h. 对于cpz处理的组织，引起屏障功能显著下降的最低剂量(67.4%)是12.5 µM at 24h; 25 µM decreased tissue viability (60.5%)在48 h. 对于hcq处理的组织，TEER下降(67.4%)检出18例.52µg/ml /ml.6%) 55.56µg/ml, 48h. 对于ALF-treated组织, 在500µg/ml浓度下，24小时后TEER和活力显著下降, 而IL-8释放增加-在0.1005µg/ml, 48h. 对于fos处理的组织，TEER显著下降(57.8%)在0.1µg/ml.浓度为10µg/ml, 48h. 观察到不同治疗方法对组织形态和LDH剂量效应的影响.

外皮组织模型对于评估具有可忽略的潜在刺激的配方是有价值的. 适用于药物的快速筛选, 会模拟全身和局部的药物暴露吗, 提高人类反应的预测性, 比动物方法更有成本效益和可复制性. 它将通过允许在临床研究之前对药物进行筛选和优化来促进全球范围内的药物发现.

一种新的巨噬细胞包含器官型 小肠组织 用来模拟肠道炎症.

凯文堤道¹, 塞尤姆Ayehunie¹, 扎卡里·史蒂文斯¹, 蒂莫西·兰德里¹,尤利娅•Kaluzhny¹, 安娜Langerveld², 伊丽莎白里海², 斯蒂芬妮·惠勒², 亚历克斯Armento¹.

马泰克公司¹，霍默大道200号，马萨诸塞州阿什兰.

²基因标记有限责任公司(genemarkeers, LLC. 密歇根州卡拉马祖南街.

会话:
星期三，三月三十日| 10:45AM - 12:30PM

摘要

作为肠道免疫稳态的门闩, 巨噬细胞在肠道炎症中起着关键作用.  在这项研究中, 我们构建了一个新的含有巨噬细胞的原代细胞为基础的全层小肠(SMI+M)组织模型，并对其进行了表征:1)巨噬细胞掺入(免疫组化), 包含IHC), 屏障特性(三通), and 3) functionality by measuring inflammatory responses following exposure to ligands for TLR4 (lipopolysaccharide; LPS), NOD-1 (C12-iE-DAP)和NOD-2 (L18-MDP)可以单独或协同使用.  为了识别炎症反应，我们使用Affymetrix基因芯片阵列.   结果表明，SMI+M组织具有3D极性，其形态和生理屏障特性与原生组织相似 在活的有机体内 组织. SMI+M组织免疫组化显示成纤维细胞层内有CD14+(巨噬细胞标记)细胞.  Using gene upregulation level of >1.配体刺激后截止点为9倍, 与SMI+M(4400个基因)相比，无巨噬细胞组织(SMI-M)表达上调的基因(1400个基因)更少。.  此外, when gene upregulation levels by ligand-induced SMI+M were compared against stimulated SMI-M even higher differences in upregulated genes (> 5200 genes) were noted. 在SMI + M, 上调的基因包括趋化因子, 趋化因子受体, FC受体, co-stimulatory分子, 干扰素, HLA是免疫细胞的特征. When we looked at 13 upregulated genes (>6-fold) in SMI+M, 与受刺激的SMI-M组织相比，配体在诱导炎症基因上调方面的协同作用更为显著. 此外, 细胞因子IL-6释放增加, IL-8, BioPlex ELISA也证实了将配体暴露于SMI+M的培养基中加入TNF-α.  总之, 我们的研究结果表明，3D SMI+M组织模型可以作为一种体外工具，研究炎症在肠道微环境中表现出的复杂细胞相互作用.

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